1.电穿孔前一至两天,将细胞转移至装有新鲜培养基的培养皿中,保证实验当天细胞量达到70-90%。
2.加培养基(不含抗生素)到24孔板中,每孔500?l,放于37℃培养箱预热。(注:使用其他孔数培养板或者100?l枪头时,加入培养基和质粒及细胞的数量见下表1)威尼德生物科技(北京)有限公司(www.bio-vleader.com),研发生产的双波全能型电穿孔仪Gene Pulser X2通过高强度的电场作用,瞬时提高细胞膜的通透性,从而吸收周围介质中的外源分子。这种技术将核苷酸、DNA与RNA、蛋白、糖类、染料以及病毒颗粒等导入原核和真核细胞内。电转化相对于其它物理和化学转化方法,是一种有价值和有效的替代方法。广泛用于植物、动物和微生物的各类细胞电穿孔。
3.将培养细胞取出,悬浮细胞直接取部分培养的细胞计数,确定细胞密度;贴壁细胞用2ml的PBS冲洗细胞,吸出PBS,加入约750?l胰酶消化3min,加入750?l培养基,终止消化,取部分细胞悬液进行细胞计数,确定细胞密度。
4.将悬浮细胞转到离心管,室温下100-400g离心力离心5min,倒掉上清。
5.向细胞中加入2mlPBS冲洗细胞,室温下100-400g离心力离心5min。
6.吸出PBS,用重悬缓冲液R重新悬浮细胞沉淀,最终使细胞密度为2.0×107个/ml。轻轻吹打细胞,使其形成单细胞悬液。(注:细胞悬液在室温时间不能超过15-30min,否则将导致细胞活性和转染效率降低)
7.将适量质粒加到1.5ml离心管中,再加入细胞悬液,轻轻混匀。所用细胞浓度、DNA和接种体积见下表1)。
8.将装有电解缓冲液装入电转杯中。
9.在仪器上设置脉冲电压、脉冲宽度、脉冲数。
10.用10?l的枪头吸细胞混合液,枪头中必须无气泡。
11.选择电穿孔方案,并按下触摸屏上的Start(开始)键。
12.电脉冲释放后,触摸屏上会显示完成,提示电穿孔完成以及脉冲时间。
13.将脉冲好的样品立即转移至准备好的装有预热培养基的培养板中。将培养板放到培养箱
培养。
14.实验结束后,倒掉移液器中E液,关闭电转仪。
15 正常培养4h,待细胞贴壁后,给细胞换新鲜的完全培养基,以去除上层的死细胞;
16 培养24h后,即可进行细胞转染效率的检测或是进行细胞实验处理。
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